抗精子抗体的检测方法

　　在进行抗精子抗体检测之前，有几个基本概念需要说明。

　　(1)由于精子抗原的复杂性决定了相应抗体的多样性，试图用一种检测方法检出全部抗体是不可能的。

　　(2)随着生殖生物学和免疫学的进步，新的检测方法不断创立，至目前为止，抗精子抗体检测方法已有 10多种，应根据临床或研究目的、抗原定位以及与不孕、不育的关系等进行选择。

　　(3)目前，在众多检测方法中，没有一种是对不孕症完全特异的抗体检测法，因为与精子结合的抗体，不一定都能造成精子生物功能障碍。临床关注的是与不孕症呈因果关系的抗体。对这类抗体的检测，女方主要检查女性血清中与精子膜抗原发生反应的抗体，检测方法多用免疫珠法和 MAR 试验进行筛选，然后用精子制动化试验和体外受精阻断试验作进一步鉴定。男性方面，主要也是检查与精子膜抗原反应的抗体，除进行免疫珠检测、MAR 试验外，可以用凝集试验、制动化试验、受精阻断试验来确定抗体的生物学活动。

　　(4)抗精子抗体检测法的分类，当前还没有统一，但分类的原则主要是根据抗体的生物活性;抗体与活精子膜抗原的结合性和与精子及其提取抗原的反应性。有人分为 2 类，亦有人分为 3类。在此，引述 1993年繁田实采用的分类表供参考(表 9-1)。

　　抗精子抗体的检测方法

　　A.与精子及其提取抗原反应的抗体检测法

　　1.致敏血球凝集反应

　　2.间接荧光抗体法

　　3.放射性核素标记测定法

　　4.酶联免疫吸附法

　　B.与运动精子膜抗原结合的抗体检测法

　　1.检测与抗原结合性的方法

　　(1)免疫珠测定法

　　(2)混合抗球蛋白反应试验(MAR)

　　2.检测抗原结合性及抗体生物活性方法

　　(1)精子凝集试验

　　(2)精子制动化试验

　　(3)受精阻断试验

　　注：A 法以固定精子作抗原，适用于间接荧光法和 ELISA 法等。

　　B 法以活精子膜糖蛋白作抗原，适用于与膜抗原反应的抗体检查。

　　一、精子凝集试验

　　精子凝集试验从最初由 Kibrik等(1952年)创立的白明胶内精子凝集试验开始连同其后的发展，一共有 4 种：① 明胶凝集试验(Kibrik，1952);② 试管玻片凝集试验(Franklin，Dukes，1964);③ 毛 细 管 凝 集 试 验(Shulman，Hekman，Pann，1971);④ 浅 盘 凝 集 试 验(Friberg，1974)。

　　(一)明胶凝集试验(gelatin agglutination test，GAT)

　　【准备】

　　(1)配制 Baker液(Bakersolution)

　　葡萄糖3.00gNa2HPO4・7H2O0.46g

　　NaCl0.20gKH2PO40.01g

　　加双蒸水至 100mL。

　　(2)用 Baker液配制 10% 白明胶溶液，并置 37℃ 水浴中备用。

　　(3)精子悬浮液：取正常新鲜精液(精子密度为 80×106/mL 左右，活动率 >60% ，a、b两级活动精子 >70% )，室温液化，用 Baker液稀释至 40×106/mL，置 37℃ 水浴中保存备用。

　　(4)待检血清及对照血清处理，均经 56℃ 水浴加热 30min，以灭活补体。随后用 Baker液，将两种血清均作 1∶4～ 1∶32倍数稀释，存放于 37℃ 水浴中备用。

　　【方法】

　　(1)取一定量的精子悬浮液，加入等量的 10% 明胶溶液，充分混合后，取 0.3mL 分别加入装有 0.3mL 对倍稀释血清的各支小试管内，并使其充分混合。

　　(2)将混合液分别用毛细吸管移置另一小试管(3mm ×30mm)内，37℃ 孵育 2h，移置 4℃放置 5min，待明胶凝固后，观察明胶内精子凝集情况，并判断结果。

　　【判断】

　　(1)阴性：精子在明胶内均匀分散，若以黑纸作背面对光观察，呈均匀乳白色，不见凝集块。

　　(2)阳性：精子成小凝集块，对光观察可见小凝集块有如雪花纷飞状，不难鉴别。

　　(3)抗体效价：以阳性反应的最高血清稀释倍数为血清凝集抗体效价。

　　(二)试管玻片凝集试验(又称为 F-D 法)

　　【准备】

　　(1)配制 Baker液(同上)或生理盐水。

　　(2)从患者血液中分离血清，经 56℃ 30min灭活补体处理，并以 Baker液或生理盐水把原血清作 1∶5稀释。

　　(3)精子悬浮液：取新鲜正常精液(同上)以 Baker液或生理盐水调整精子数为 4 ×106/mL。

　　【方法】

　　(1)取 0.25mL 处理后待检血清移置一小试管，加入 0.25mL 精子悬浮液。在另一小试管内加0.25mL Baker液或生理盐水，再加入 0.25mL 精子悬浮液作阴性对照。

　　(2)在 37℃ 条件下孵育 30min、60min、120min、240min，从小试管内分别取出一滴混合液放在载玻片上，加上盖玻片。

　　(3)在高倍镜下(400× )，观察精子凝集情况。

　　【判断】

　　阴性：未见精子凝集。

　　阳性：在 10个高倍视野下，有 5个以上视野出现 2个以上精子凝集者，判为阳性。

　　注：1991年张秀成对本法的操作略有变动：① 精子悬液，取新鲜精液后，用 Baker液洗3次，调精子浓度为 5×106/mL 供试验用;② 血清及精子悬液用量均为 0.1mL;③ 37℃ 孵育 1h;④ 有 3条精子以上凝集为阳性。